O exame parasitológico direto pode alcançar até 100% de positividade nas formas mucosas recentes (até quatro meses de evolução).

A intradermoreação de Montenegro apresenta sensibilidade de 85% a 90%, principalmente a partir do segundo mês de evolução da doença. Pode ainda ser falso positiva em doentes que vivem em área endêmica, e falso negativa em casos de leishmaniose cutânea difusa.

A reação em cadeia de polimerase é útil para o diagnóstico de casos com lesão mucosa, podendo ainda ser positiva em casos com lesão cutânea cicatrizada há longa data.

A histopatologia varia desde inflamação exsudativa aguda até a formação de granuloma tuberculoide completo, podendo haver infiltração linfo-histiociocitária ou plasmolinfo-histiocitária.