O ELISA (Enzyme linked immuno Sorbent Assay) é um método de imunodetecção de substâncias a partir da interação entre antígeno-anticorpo, que realiza uma ligação específica seja ela diretamente ou indiretamente.
A técnica simula a reação de imunidade adaptativa que ocorre no corpo humano, no qual após exposição a agentes nocivos ou alergênicos o corpo produz proteínas de ligação específicas contra antígenos presentes nesses agentes, os anticorpos. Ou seja, o ELISA utiliza proteínas específicas de ligação e antígenos específicos para observar se existe reação no corpo na presença dessa adição.
#Ponto importante: o antígeno aqui não representa apenas epítopos presentes em microrganismos patológicos, mas também locais específicos de hormônios, proteínas, glicoproteínas, marcadores, entre outros.
A alta sensibilidade e especificidade para diversas doenças infecciosas e autoimunes, além da simplicidade da técnica, baixo custo e a possibilidade de ser reproduzida com facilidade em qualquer local fez do ELISA o método de imunoensaio padrão.
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Indicações do teste
- Detectar e medir a presença de anticorpos no sangue de doenças infecciosas (antibacterianos, antivirais, antifúngicos) e autoimunes (autoanticorpos anti-dsDNA, anti-dsg1, ANA, etc.).
- Na seleção de doadores de sangue das doenças virais transmitidas pelo sangue,
- como hepatites B e C, AIDS, HTLV-I e II.
- Detectar e estimar os níveis de marcadores tumorais (ex., Antígeno prostático específico).
- Detectar e estimar os níveis hormonais ( LH, FSH, Prolactina, Testosterona, BhCG
- Detectando Exposições Passadas (IgG para Rubéola, hepatite, toxoplasmose etc.).
- Detecção de Abuso de Drogas ( ex., anfetaminas, cocaína ou benzoilecgonina).
- Na avaliação da imunidade naturalmente adquirida após uma infecção viral ou artificialmente induzida após vacinação, pela pesquisa de anticorpos da classe IgG.
- Pesquisa e diagnóstico de alergia, incluindo variações ultrassensíveis para detectar quantidades de alérgenos na escala de picogramas.
- Estudos epidemiológicos, para avaliação da prevalência de diferentes doenças virais em uma determinada comunidade.
#Ponto importante: O ELISA é uma ferramenta de triagem para detecção do HIV, mas não para diagnóstico, requerendo testes adicionais por Western Blot devido a possíveis falsos positivos.
Técnica do ELISA
Para a formulação do ELISA existem quatro técnicas principais, que a depender das condições a serem diagnosticadas podem ser melhores indicada:
ELISA direto: A primeira etapa de ligação envolve a adição de antígeno às placas através do material a ser analisado, sofre período de incubação e depois lavagem da placa com material específico para evitar que anticorpos naturais se liguem aos antígenos.
Em seguida é introduzido um anticorpo de detecção primária conjugado com enzima e um substrato para coloração. Ou seja, ao final da solução apenas um anticorpo primário marcará o antígeno diretamente.
É muito utilizado nos testes de gravidez para a detecção da gonadotrofina coriônica humana (BHCG). Suas desvantagens incluem sua baixa sensibilidade em relação aos outros tipos de ELISA e seu alto custo de reação.
ELISA indireto: A placa também é revestida com antígeno, mas ocorre em duas etapas. A primeira amostra é similar ao teste direto, sendo preparada com o anticorpo primário na qual tem afinidade para o antígeno que vai ser detectado.
No entanto, é realizada uma lavagem para retirada daqueles que não tiveram afinidade e logo não realizaram a ligação. Nesse momento o anticorpo secundário é introduzido e ele se ligará aos anticorpos primários. Esse método permite um aumento na especificidade do teste.
No teste de HIV, uma amostra de sangue ou saliva é coletada para teste, geralmente usando testes indiretos baseados em ELISA.
ELISA sanduíche: Ao contrário do ELISA direto e indireto, a placa inicialmente é revestida de anticorpos de captura, seguido pela adição da amostra a ser analisa com os antígenos e lavagem dos não ligantes. Posteriormente, os anticorpos conjugados a enzima (de detecção) são adicionados que irão reconhecer a presença do antígeno.
É denominado o termo sanduíche justamente porque os antígenos são colocados entre duas camadas de anticorpos. Chama de teste de terceira geração, é muito utilizado para detecção do HIV. As principais desvantagens deste tipo de ELISA são o tempo e o custo e a necessidade do uso antígeno multivalente e anticorpos secundários.
ELISA competitiva: Esse teste provoca uma competição entre os antígenos da amostra a ser pesquisado e um antígeno idêntico ao que se procura nela, mas com o marcador. Ambos irão competir pelos anticorpos de captura.
O antígeno marcado se liga menos quanto mais antígenos alvos na amostra, indicando que os antígenos procurados se ligaram comprovando a sua presença. Quanto menos antígeno na amostra, mais o antígeno marcado é retido no poço e mais forte é o sinal. A desvantagem é que possui em baixa especificidade e não pode ser usado em amostras diluídas.
Análise de resultado do ELISA
Quando a enzima realiza a interação com o substrato, há uma mudança na coloração e essa é usada como marcador para a interpretação do resultado. Enquanto resultados qualitativos confirmam ou negam a presença de um determinado antígeno ou anticorpo em uma amostra, dados quantitativos fornecem valores a partir das mudanças de cor no imunoensaio que são comparados com uma curva padrão.
Os anticorpos utilizados nos ensaios podem ser imunoglobulinas A (IgA), D (IgD), E (IgE), G (IgG) e M (IgM) específicas, que auxiliam, por exemplo, na diferenciação de processos infecciosos ativos ou passados.
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Referências bibliográficas:
- Alhajj M, Farhana A. Ensaio de Imunoabsorção Enzimática. [Atualizado em 2 de fevereiro de 2022]. In: StatPearls [Internet]. Ilha do Tesouro (FL): StatPearls Publishing; 2022 Jan-. Disponível em: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK555922/
- FRANCO, Victor Luiz de Matos. A técnica de elisa e a sua importância para o diagnóstico clinico. Brazilian Journal of Development, Curitiba, v.7, n.9, p. 89877-89885 sep. 2021. DOI:10.34117/bjdv7n9-243
- Vitral, Cláudia Lamarca. Ensaio imunoenzimático (elisa). UFF, 2017.
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